TINCIÓN DE GRAM

LABORATORIO # 2

TINCIÓN DE GRAM

OBJETIVO

          El alumno aplicará una  técnica  de coloración diferencial para la identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas..

MATERIAL

Asa de platino                                                             Cultivos de Escherichia coli

Microscopio                                                                Cultivo de Staphylococcus aureus

Porta objetos                                                              Cultivo de Cándida albicans

Aceite de  inmersión                                    Esputo de tuberculoso procesado en autoclave

SUSTACIAS COLORANTES

Colorante violeta cristal de Gram                               

Solución decolorante alcohol  acetona                                    

Safranina de Gram

Yodo de Gram o lugol para gram

INTRODUCCIÓN

TINCION DE GRAM.

          Tinción empleada en microbiología para la visualización de bacterias en muestras clínicas. También se emplea como primer paso en la diferenciación bacteriana. El examen con microscopio óptico de preparación con tinción de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes son cocos ( esféricas), bacilos (alargadas) y formas espiraladas

          Las bacterias pueden diferenciarse con esta tinción en dos grupos. Los microorganismos Gram. positivos se tiñen de azul, mientras que aproximadamente  un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos espira lados se tiñen de rojo y se dice que son gramnegativos.

          Las aplicaciones más comunes  de la coloración de Gram son las siguientes:

          La presencia de cocos grampositivos agrupados sugiere estafilococos; en cadenas sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos

         La presencia de diplococos gramnegativos son características de especies de Neisseria

       Los bacilos Gram. positivos grandes sugieren especies de Bacillus o clostridium, los bacilos Gram. positivos pequeños sugieren especies de Listeria o una de las corineiformes ( difteroides)

        Los bacilos Gram. negativos son las bacterias mas comunes halladas en los laboratorios clínicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentados y  especies de Haemophilus.

         El valor diagnóstico de esta tinción es variable; normalmente permite una buena orientación al microbiólogo para seleccionar las técnicas de cultivo más adecuadas y también tiene valor en orientar hacia un diagnóstico etiológico, en especial para instaurar un tratamiento inicial.

PROCEDIMIENTO

REALIZACIÓN DEL FROTIS

1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua, que resulta suficiente.
2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.
3. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.

A)     TINCIÓN  DE GRAM

1. Realiza la preparación del  frotis bacteriano como se explicó  en el paso anterior
2. Teñir con cristal violeta 1min.
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Cubrir con  Lugol 1min.
5. Lavar con agua el exceso de Lugol.
6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación deje de perder color (30seg)
7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
8. Teñir con safranina 1min.
9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
10. Secar la preparación.
11. Examinar al microscopio con aceite de inmersión y fijándose sobre todo en el color de cada preparación.

1.- ¿Qué es un frotis?

-Un frotis  es un mecanismo científico que consiste en el extendido de una gota  en la superficie de un portaobjetos o de un cubreobjetos, con el fin de analizarla posteriormente.

2.- ¿Con qué finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta objetos?

Se fija el frotis por calor o por agentes químicos. Con las siguientes finalidades:
- Se evita la deformación de las células con el colorante.
- Para posicionar las estructuras internas y externas de la célula
- Además se mata al microorganismo.
- Preserva la morfología general pero no las estructuras internas.
-Protege la subestructura fina y la morfología de los microorganismos delicados de mayor tamaño

3.-¿Qué importancia tiene teñir las muestras bacterianas?

La tinción bacteriana tiene dos propósitos fundamentales:
a) Identificar la bacteria (Gram positiva o Gran negativa).
b) Con base en la identificación, indicar el tratamiento correcto (los antibióticos no funcionan por igual para bacterias Gram positivas que Gram negativas).
Ademas Tincionar las bacterias es importante para poder verlas en el microscopio, dependiendo el tipo de bacterias se tinciona de cierta manera siguiendo un protocolo.

4.- ¿Por qué es necesario emplear aceite de inmersión para la observación de los microorganismos?

El aceite de inmersión tiene aproximadamente el mismo índice de refracción que el vidrio y con el se elimina casi completamente los rayos de la luz y aumenta en gran cantidad la eficacia del uso del microscopio.
Al ofrecer un índice de refracción similar al del vidrio, el objeto aparece como "incluido en el vidrio del objetivo" eliminando el efecto reflector del vidrio exterior del. Eso permite lograr mucho mayores aumentos con menor distorsión esférica, menor aberración cromática y mayor luminosidad o "abertura de pupila".

5.-De los reactivos que utilizaste para la tinción de Gram, ¿cuál es el que

violeta cristal es el que funciona como colorante primario.

6.-¿Qué función tiene el Yodo en la tinción de Gram?

El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. El lugol es un compuesto formado por yodo en equilibrio con  yoduro de potasio, el cual está presente para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana..

7.-¿Qué coloración tiñen las bacterias Gram positivas?

Las Bacterias Gram positivas. Poseen una pared celular gruesa con numerosas capas de peptidoglucano, las cuales retienen el colorante cristal violeta. Algunas de estas bacterias se rodean además de una cápsula o cubierta gruesa y viscosa de polisacáridos. AZUL

.8.- ¿Qué coloración tiñen las bacterias Gram. negativas?

Las Bacterias Gram negativas. Poseen una pared celular fina y una segunda membrana lipídica denominada membrana externa, la cual no retiene el colorante cristal violeta, como en Escherichia coli, de ahí que tome una tonalidad de color rosado.

9.- Menciona tres bacterias que tiñen Gram positivas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas

 Erisipelotricosis: es una infección cutánea de lento desarrollo causada por la bacteria Erysipelothrix rhusiopathiae.
A pesar de que la Erysipelothrix rhusiopathiae crece principalmente en un medio con materia muerta o en descomposición, también puede infectar a insectos, moluscos, peces, aves y mamíferos.
- Listeriosis: es una enfermedad causada por Listeria monocitogenes, da lugar a una sintomatología diversa de acuerdo con el lugar en que se produce la infección y la edad de la persona afectada.
La Listeria se encuentra en todo el mundo, tanto en el ambiente como en los intestinos de los pájaros, las arañas, los crustáceos y los mamíferos no humanos.
- Ántrax: es una enfermedad causada por la bacteria Bacillus anthracis, que puede infectar la piel, los pulmones y el aparato gastrointestinal.
El ántrax es una enfermedad muy contagiosa y potencialmente mortal. Por lo general, pasa a las personas a través de algunos animales, en especial las vacas, las cabras y las ovejas.

10.- Menciona tres bacterias que tiñen Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas.

a) Las Enfermedades Vasculares se caracterizan por la invasión de los haces vasculares los cuales se llenan de bacterias y producto

de su metabolismo obstaculizan el flujo de agua y nutrientes a través de toda la planta, provocando su marchitamiento y muerte. Por ejemplo: Erwinia trachephila. 
b) Las Enfermedades Parenquimáticas, aquí Las bacterias invaden los tejidos suculentos y después de invadir los tejidos vasculares adyacentes provocando tizones, necrosis o manchas foliares. Por ejemplo: Pseudomonas syringae pv. phaseolícola. 
c) Las Enfermedades Hiperplásticas, aquí las bacterias invaden cualquier parte de la planta, luego secretan sustancias reguladoras de crecimiento (Auxinas, Giberelinas, etc.), las cuales debido a su adición, a la cantidad normal de la planta, causan aumento y división celular normal del tejido afectado, causando excesiva proliferación de tejidos (tumores) y formación de órganos adicionales. 

Cuáles son las fuentes de errores más comunes de error en la tinción de gran

Los peores obstáculos de la Tinción, que impiden conseguir el resultado perseguido, son los errores del técnico. Para evitarlos hay que elegir bien los reactivos y ser muy cuidadosos al ejecutar la técnica. A continuación describimos algunas de las fuentes de error: Impurezas en los reactivos de Tinción.

Concentración inadecuada de los reactivos de tinción.

pH inadecuado. 

El colorante se fija a la célula por mecanismos físico-químicos, que se alteran si el Ph no es el apropiado. 

Los colorantes pueden ser ácidos, básicos o neutros.

Tiempo de Tinción incorrecto.

Temperatura suficiente.

2. Explique que reacción de Gram darán las levaduras. Estos tendrán la misma importancia que para las bacterias.

El color depende de la composición de la pared celular de la levadura y no tiene tanta importancia como las bacterias ya que en ellas existe toda una clasificación por medio del gram lo que no sucede con las levaduras. 

3. Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la practica. Que tipo de información se obtiene.

La Tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La Tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

4. Investigue otra técnica de tinción selectiva que permita observar otras estructuras bacterianas.

Las Tinciones Selectivas nos permiten observar estructuras de las células gracias a su mayor afinidad por los colorantes utilizados. 

5. ¿A qué se debe el distinto comportamiento de las bacterias según sean Gram+ o Gram-?

El distinto comportamiento en la Tinción se piensa que es debido a las diferentes capas superficiales o paredes de las dos bacterias (Tipos de Células). 

6. ¿Para qué se necesita el aceite de inmersión?

El aceite de inmersión tiene un indice de refracción similar al del vidrio (1,5 aprox.) y se utiliza para el objetivo de 100X. 

OBSERVACIONES:

Realiza los dibujos y esquemas correspondientes a las tinciones realizadas

CONCLUSIONES:

La diferencia química es los que permite distinguir las bacterias por Tinción, el colorante reacciona con la célula bacteriana, pero no reacciona con su medio exterior.  

Debido a eso la Tinción es importante para la microbiología ya que : 

Proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciarlas.

Permite el estudio de las estructuras internas de la célula bacteriana.

Permite el empleo de mayores amplificaciones.