sábado, 7 de diciembre de 2013

TINCIONES SELECTIVAS

LABORATORIO # 4

TINCIONES SELECTIVAS

 

 OBJETIVO
El alumno aplicará la técnica de tinción específica para lograr observar en el microscopio la pared celular y endoesporas  en  distintas muestras bacteriológicas

MATERIAL


Cultivo de 12 a 18 horas de Bacillus Suptillus ( lacto bacilos) en Agar  nutritivo y Agar sangre
Cultivo de Bacillus  cereus ( tierra contaminada y tratada a 80·C por 10 minutos) en Agar nutritivo y Agar sangre
Cultivo de 24 horas de Staphylococcus aureus en manitol sal Agar  (msa)
Solución de ácido fosfomolíbdico ( 1%)
Solución acuosa de verde de metilo ( 1%)
Verde malaquita ( solución acuosa al 5%)
Safranina ( solución acuosa al 5% )
Portaobjetos
Cubreobjetos
Microscopio compuesto
Asa bacteriológica
Mechero Bunsen

INTRODUCCIÓN

PARED CELULAR
          Debajo de las sustancias extracelulares tales como las cápsulas o capas mucosas y externas a la membrana citoplasmática está la pared celular que es una estructura muy rígida y que da forma a la célula. El espesor de la pared celular oscila entre 10 y 35 nm, sin embargo algunas paredes celulares son considerablemente más gruesas.
          Las paredes celulares bacterianas son esenciales para el crecimiento y la división. Todas las bacterias poseen paredes celulares rígidas que protegen a la célula de explotar en medios de baja presión osmótica.
          Composición química de las paredes celulares.-  Los peptidoglicanos proporcionan a la pared celular una estructura rígida. Estos grandes polímeros, están compuestos de  tres clases de bloques estructurales: N- Acetil-Glucosamina, Ácido N- Acetil-Murámico y un péptido que consta de  cuatro o cinco aminoácidos que son: L- alanina, D-Alanina, _D-Ácido Glutámico y Lisina. Además contiene proteínas con polisacáridos, lipoproteínas y lipopolisacáridos
Propiedades y Funciones: 1= Brinda protección y resistencia a la bacteria frente a los posibles cambios de presión osmótica del medio en el que se encuentra y a la acción de ciertos agentes externos.2= Presenta Poros que actúan como filtros, permitiendo el pasaje de agua y metabolitos esenciales.3= Presenta antígenos de tipo y grupo específicos.4= Participa en la división (multiplicación) bacteriana (se invagina junto con la membrana plasmática)5= En las bacterias Gram .negativas tiene poder patógeno debido a que presenta endotoxinas (Lípido A).6= Es el sustrato donde actúan los  - Lactámicos y otros antimicrobianos.
          La tinción para la pared celular se aprovecha del hecho de que los contenidos citoplasmáticos se pueden hidrolizar diferencialmente con ácido fosfomolíbdico, dejando la pared sin afectar. Después de teñir se puede observar la pared celular con citoplasma como ahuecado
ESPORAS
          Son elementos de reproducción y/o de resistencia a un medio adverso que presentan algunas bacterias , especialmente del género bacilar. Su forma, tamaño y ubicación varía según la especie. Estos cuerpos son producidos en el último estadío del crecimiento celular, que bajo condiciones apropiadas, germinan y producen la clase original de célula en crecimiento o vegetativa.
PROCEDIMIENTO
A) TINCIÓN DE LA PARED CELULAR
1.- Prepara un frotis húmedo relativamente concentrado de Bacillus Suptillus sobre un portaobjetos limpio . NO LO FIJES A LA FLAMA. Prepara otro con B. cereus
2.-Antes de que la suspensión bacteriana se seque sobre el portaobjetos, adiciónale la solución del ácido  fosfomolíbdico cubriéndola por completo.
3.- Déjalo reaccionar 4 minutos.
4.- Inclina completamente el portaobjetos sobre el fregadero para eliminar totalmente el ácido fosfomolíbdico
5.-Agrega el verde de metilo directamente sobre el frotis húmedo y déjalo reaccionar 5 minutos.
6.- Lava suavemente en la llave. Es inevitable que al lavar en la llave, algo del material se
desprenda del frotis, trata de minimizar el desprendimiento pero al mismo tiempo lava bien, hasta  que el agua ya no arrastre colorante.
7.- Seca al aire y después examina con aceite de inmersión
8.- Si se tiñó correctamente, las paredes celulares aparecerán de verde oscuro o azul, mientras que el citoplasma se verá de un verde claro o incoloro.


A) TINCIÓN DE ESPORAS  ( TÉCNICA DE SHEAFFER Y FULTON)

1-Prepare un dos extendidos del microorganismo aislado del cultivo de microorganismo uno de  Bacillus Suptillus y  otro de  Bacillus  cereus
2-Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solución de verde de Malaquita.
3-Calentar hasta emisión de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos (no permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.)
4-Lavar con agua y cubrir con solución de Safranina. Dejar actuar 30 segundos. Lavar con agua, secar y observar con objetivo de inmersión.
5-Informar: morfología, color y tipo de espora.








CUESTIONARIO


1.- Menciona dos funciones que tiene la pared celular en las bacterias.

-       Son esenciales para el crecimiento y la división
-       Protegen a la célula de explotar en medios de baja presión osmótica.

2.-¿Cuáles son los principales compuestos orgánicos de las paredes celulares?
Los peptidoglicanos.

3. ¿Qué característica y que  color tiñeron   las paredes celulares de  las bacterias que lograste observar?

Las paredes celulares aparecieron como un azul oscuro, mientras que el citoplasma se notó un verde claro

4.- Investiga las diferencias de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-positivas presentan sólo una membrana lipídica y la pared de peptidoglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tinción de Gram.

5.- Describe  dos  diferencias   para distinguir a una endospora de una exospora

-       La Endospora se presenta en el interior de la bacteria
-       La Exospora permanece libre en el ambiente

6. ¿Qué característica y que color tiñeron las esporas observadas en las distintas muestras microbiológicas?

Las esporas adquieren color verde y las células vegetativas se tiñen de rojo.


7.- Menciona algunos microorganismos capaces de producir esporas

Bacillus, clostridium y  Sporosarcina.

CONCLUSIONES

Las tinciones selectivas son aquéllas que permiten observar una estructura celular

determinada, algunas bacterias tienen la capacidad de producir endosporas o producir exopolisacáridos conocidos como cápsulas. Las endosporas bacterianas estructuras de resistencia que se caracterizan por presentar varias capas compuestas de proteínas y azúcares complejos, mientras que en el protoplasto de la misma existe un complejo de dipicolinato de calcio, debido a esta composición, es muy difícil que los colorantes penetren, por lo que al aplicar una tinción simple, estas aparecen como cuerpos incoloros (dentro o fuera de la célula).

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