TINCIONES SELECTIVAS

LABORATORIO # 4

TINCIONES SELECTIVAS

 

 OBJETIVO

El alumno aplicará la técnica de tinción específica para lograr observar en el microscopio la pared celular y endoesporas  en  distintas muestras bacteriológicas

MATERIAL

Cultivo de 12 a 18 horas de Bacillus Suptillus ( lacto bacilos) en Agar  nutritivo y Agar sangre

Cultivo de Bacillus  cereus ( tierra contaminada y tratada a 80·C por 10 minutos) en Agar nutritivo y Agar sangre

Cultivo de 24 horas de Staphylococcus aureus en manitol sal Agar  (msa)

Solución de ácido fosfomolíbdico ( 1%)

Solución acuosa de verde de metilo ( 1%)

Verde malaquita ( solución acuosa al 5%)

Safranina ( solución acuosa al 5% )

Portaobjetos

Cubreobjetos

Microscopio compuesto

Asa bacteriológica

Mechero Bunsen

INTRODUCCIÓN

PARED CELULAR

          Debajo de las sustancias extracelulares tales como las cápsulas o capas mucosas y externas a la membrana citoplasmática está la pared celular que es una estructura muy rígida y que da forma a la célula. El espesor de la pared celular oscila entre 10 y 35 nm, sin embargo algunas paredes celulares son considerablemente más gruesas.

          Las paredes celulares bacterianas son esenciales para el crecimiento y la división. Todas las bacterias poseen paredes celulares rígidas que protegen a la célula de explotar en medios de baja presión osmótica.

          Composición química de las paredes celulares.-  Los peptidoglicanos proporcionan a la pared celular una estructura rígida. Estos grandes polímeros, están compuestos de  tres clases de bloques estructurales: N- Acetil-Glucosamina, Ácido N- Acetil-Murámico y un péptido que consta de  cuatro o cinco aminoácidos que son: L- alanina, D-Alanina, _D-Ácido Glutámico y Lisina. Además contiene proteínas con polisacáridos, lipoproteínas y lipopolisacáridos

Propiedades y Funciones: 1= Brinda protección y resistencia a la bacteria frente a los posibles cambios de presión osmótica del medio en el que se encuentra y a la acción de ciertos agentes externos.2= Presenta Poros que actúan como filtros, permitiendo el pasaje de agua y metabolitos esenciales.3= Presenta antígenos de tipo y grupo específicos.4= Participa en la división (multiplicación) bacteriana (se invagina junto con la membrana plasmática)5= En las bacterias Gram .negativas tiene poder patógeno debido a que presenta endotoxinas (Lípido A).6= Es el sustrato donde actúan los  - Lactámicos y otros antimicrobianos.

          La tinción para la pared celular se aprovecha del hecho de que los contenidos citoplasmáticos se pueden hidrolizar diferencialmente con ácido fosfomolíbdico, dejando la pared sin afectar. Después de teñir se puede observar la pared celular con citoplasma como ahuecado

ESPORAS

          Son elementos de reproducción y/o de resistencia a un medio adverso que presentan algunas bacterias , especialmente del género bacilar. Su forma, tamaño y ubicación varía según la especie. Estos cuerpos son producidos en el último estadío del crecimiento celular, que bajo condiciones apropiadas, germinan y producen la clase original de célula en crecimiento o vegetativa.

PROCEDIMIENTO

A) TINCIÓN DE LA PARED CELULAR

1.- Prepara un frotis húmedo relativamente concentrado de Bacillus Suptillus sobre un portaobjetos limpio . NO LO FIJES A LA FLAMA. Prepara otro con B. cereus

2.-Antes de que la suspensión bacteriana se seque sobre el portaobjetos, adiciónale la solución del ácido  fosfomolíbdico cubriéndola por completo.

3.- Déjalo reaccionar 4 minutos.

4.- Inclina completamente el portaobjetos sobre el fregadero para eliminar totalmente el ácido fosfomolíbdico

5.-Agrega el verde de metilo directamente sobre el frotis húmedo y déjalo reaccionar 5 minutos.

6.- Lava suavemente en la llave. Es inevitable que al lavar en la llave, algo del material se

desprenda del frotis, trata de minimizar el desprendimiento pero al mismo tiempo lava bien, hasta  que el agua ya no arrastre colorante.

7.- Seca al aire y después examina con aceite de inmersión

8.- Si se tiñó correctamente, las paredes celulares aparecerán de verde oscuro o azul, mientras que el citoplasma se verá de un verde claro o incoloro.

A) TINCIÓN DE ESPORAS  ( TÉCNICA DE SHEAFFER Y FULTON)

1-Prepare un dos extendidos del microorganismo aislado del cultivo de microorganismo uno de  Bacillus Suptillus y  otro de  Bacillus  cereus

2-Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solución de verde de Malaquita.

3-Calentar hasta emisión de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos (no permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.)

4-Lavar con agua y cubrir con solución de Safranina. Dejar actuar 30 segundos. Lavar con agua, secar y observar con objetivo de inmersión.

5-Informar: morfología, color y tipo de espora.

CUESTIONARIO

1.- Menciona dos funciones que tiene la pared celular en las bacterias.

-       Son esenciales para el crecimiento y la división

-       Protegen a la célula de explotar en medios de baja presión osmótica.

2.-¿Cuáles son los principales compuestos orgánicos de las paredes celulares?

Los peptidoglicanos.

3. ¿Qué característica y que  color tiñeron   las paredes celulares de  las bacterias que lograste observar?

Las paredes celulares aparecieron como un azul oscuro, mientras que el citoplasma se notó un verde claro

4.- Investiga las diferencias de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-positivas presentan sólo una membrana lipídica y la pared de peptidoglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tinción de Gram.

5.- Describe  dos  diferencias   para distinguir a una endospora de una exospora

-       La Endospora se presenta en el interior de la bacteria

-       La Exospora permanece libre en el ambiente

6. ¿Qué característica y que color tiñeron las esporas observadas en las distintas muestras microbiológicas?

Las esporas adquieren color verde y las células vegetativas se tiñen de rojo.

7.- Menciona algunos microorganismos capaces de producir esporas

Bacillus, clostridium y  Sporosarcina.

CONCLUSIONES

Las tinciones selectivas son aquéllas que permiten observar una estructura celular

determinada, algunas bacterias tienen la capacidad de producir endosporas o producir exopolisacáridos conocidos como cápsulas. Las endosporas bacterianas estructuras de resistencia que se caracterizan por presentar varias capas compuestas de proteínas y azúcares complejos, mientras que en el protoplasto de la misma existe un complejo de dipicolinato de calcio, debido a esta composición, es muy difícil que los colorantes penetren, por lo que al aplicar una tinción simple, estas aparecen como cuerpos incoloros (dentro o fuera de la célula).

TINCIÓN ACIDO-ALCOHOL RESISTENTE

LABORATORIO # 5

TINCIÓN ACIDO-ALCOHOL RESISTENTEObjetivos

Aplicar  las técnicas  de coloración de microorganismos ácido-resistentes para diferenciarlos e identificarlos, en base a sus propiedades morfológicas.

Materiales

·         Un cultivo de 72 horas de mycobacterium.

·         Un cultivo de 24 horas de streptococcus.

Reactivos

·         Azul de metileno

·         Alcohol acidulado

Procedimientos

1.                  Prepara un frotis bacteriano. Haciendo un delgado extendido del material para su estudio y permitir que se seque al aire.

2.                  Fijar el frotis con calor, evitar que hierva

3.                  Cubrir la preparación con carbofucsina. o fuscina fenicada

4.                  Calentar la preparación en un mechero Bunsen durante 5 min. No debe hervir. Si se evapora, se añade más carbofucsina para que no se seque en ningún momento.

5.                  Lavar con agua el resto de colorante.

6.                  Decolorar con la mezcla ácido-alcohol.  Hasta que solo permanezca un  tenue color  rosa.

7.                  Lavar con agua para que no prosiga la decoloración.

8.                  Teñir con azul de metileno 1 min.

9.                  Lavar con agua el resto de colorante.

10.              Secar la preparación.

11.              Examinar al microscopio. Con objetivo de inmersión por 100 X ( aceite)

*La tinción es positiva para bacilos rojos contra un fondo azul claro

Cuestionario

1.      ¿Qué  Clasificación  de bacterias pueden ser encontradas en este tipo de tinción?

En esta tinción es muy limitado el número de géneros de bacterias de ácido-alcohol resistente:

·         Mycobacterium

·         Nocardia

2.      ¿Qué otro nombre recibe la  tinción ácido- alcohol- resistente?

      La tinción de ácido-alcohol resistente también recibe el nombre de tinción de Ziehl-Neelsen.

3.      ¿Qué coloración se tiñen las bacterias bacilares en la tinción ácido- alcohol- resistente que da como resultado la reacción positiva?

Si la tinción es positiva las bacterias bacilares se tiñen de rojo contra un fondo azul claro.

4.      ¿Qué función tiene el alcohol en la técnica de tinción?

El alcohol tiene como función la decoloración de la pared de las células para que puedan ser clasificadas y conservarlas por más tiempo.

5.      ¿Qué especies de Mycobacterium son los causantes de la tuberculosis?

·         Mycobacterium tuberculosis

6.      ¿Qué especie de Mycobacterium es el responsable de la lepra?

·         Mycobacterium leprae

Conclusión

La tinción Ácido-alcohol resistente es la propiedad física de algunas bacterias a la resistencia a la decoloración de la fucsina básica (rojo) la cual penetra en la célula por acción del fenol y el calor.

Las bacterias ácido-alcohol resistentes no pueden ser clasificados según la tinción de Gram.

               La tinción acido-alcohol resistente solo tiñe bacterias:Mycobacterium, Nocardia

laboratorio # 7

SEMBRADO EN PLACA DE microorganismos del medio ambiente

 

Objetivos

 

-         Observar la gran variedad de microrganismos presentes en el medio ambiente, determinando las diferentes morfologías de colonias que se obtienen.

-         Los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias de bacterias en un medio de cultivo en cajas de Petri.

MATERIAL

• 3 cajas de Petri estériles preparadas con Agar nutritivo
• Caja de hisopos estériles sin abrir toallas de papel
• 3 cajas de petri estériles preparadas  con Agar sangre.
• Cinta pegante
• Marcador permanente o lápiz de cera
• Un desinfectante con 70% de solución de alcohol, 10% de una solución blanqueadora, jabón líquido Extran o alkox , septisol.

INTRODUCCIÓN

La población microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja. Cientos de especies microbianas habitan normalmente en distintas partes de nuestro cuerpo, incluidas la boca, el tracto intestinal y la piel. Al nacer, los microbios inmediatamente empiezan a colonizar nuestros cuerpos, así como a casi todos los objetos del mundo. Ellos flotan alrededor hasta que entran en contacto con una superficie que ofrezca comida y resguardo. Se encuentran más frecuentemente en la oscuridad, en objetos húmedos que a menudo entran en contacto con la comida, la suciedad o la vegetación. Las superficies del baño, los cepillos para el cabello, los refrigeradores, los lavaplatos y las tablas de cocina tienen a menudo muchos microbios. Las manijas y las paredes tienen menos porque son pobres en nutrientes y secos.

Un estudio adecuado de microorganismos que hay en estos hábitat requiere técnicas que permitan conocer y ordenar la compleja población mixta o cultivo mixto, separándole en sus distintas especies como cultivos puros. Un cultivo puro consta de una población de células derivadas todas ellas de una célula parental. Los microorganismos se cultivan en el laboratorio sobre materiales nutritivos denominados medios. Se dispone de una gran cantidad de medios y la clase que se debe de utilizar depende de muchos factores, uno de los cuales es la clase de microorganismos que se va a cultivar. El material que se inocula sobre el medio se denomina inóculo mediante alguna técnica (siembra por estría en placa o siembra en masa en placa). Durante la incubación a 37:C , las células microbianas individuales se reproducen tan rápidamente que en un lapso de 18 a 24 horas producen masas visibles de células denominadas colonias. Una colonia es visible a simple vista. Cada colonia  diferente es presumiblemente un cultivo puro de una sola clase de microorganismo. Si dos células microbianas procedentes del inóculo original quedan muy cerca una de otra sobre el medio de Agar, la masa de células observables no será un cultivo puro. La mayoría de los microbios en nuestro cuerpo y otras superficies son inofensivas, pero algunos son patógenos o causan enfermedad. Por esta razón, queremos controlar el número de microbios que nos rodea. La posibilidad de infectarnos aumenta con el número de microbios en los objetos circundantes. Pero ¿qué podemos hacer para reducir el número de microbios en las superficies que nos rodean?

PROCEDIMIENTO

En esta actividad escogerás un fomite (cualquier objeto inanimado que pueda causar enfermedad en los organismos por contener microorganismos como: la manija, el marco, el control remoto de la televisión, una moneda). Este fomite ayudará a confirmar la presencia de microbios y los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias de bacterias en un medio de cultivo en cajas de Petri.

1. Si tienes el cabello largo, recógetelo para mantenerlo lejos de las cajas de Petri cuando estés trabajando. Lava tus manos. Limpia tú área de trabajo frotando suavemente, con la solución desinfectante en una toalla de papel. Saca tus cajas de Petri pero no abras las cajas hasta que se te indique.

2. Escoge un objeto del salón de laboratorio (la manija, el marco, el control remoto de la televisión, una moneda, etc.). Toma una caja de Petri sin abrir y con tú lápiz de cera o marcador, divide la base de la caja en cuatro secciones iguales. Escribe el nombre del objeto al otro lado y designa las secciones de 1 hasta 4. Abre la caja de hisopos de algodón y escoge uno con cuidado para no tocar la punta. Limpia tú objeto escogido con todos los lados de la punta del hisopo volteándolo y retorciendo el hisopo a medida que lo mueves por la superficie del objeto.

3. Ahora abre la tapa de la caja y suavemente haz cuatro siembras sobre la superficie de la caja como se muestra en la ilustración, empezando en la sección designada "1" y continuando en el orden de las secciones, de manera que la última siembra esté en la sección 4. Presiona firme pero suavemente y no retiñas las siembras anteriores. Tus siembras sólo deben dejar una impresión muy ligera en el Agar. Cierra la caja y séllala con dos pedazos de cinta. No cubras la caja con cinta o no podrás verla bien.

4. Divide una segunda caja de Petri en 4 secciones numeradas de 1 hasta 4 y desígnala “Control.” Limpia la mitad del objeto que escogiste anteriormente con una toalla de papel humedecida con agua-solo frótala un par de veces; no la restriegues. Con un nuevo hisopo estéril, toma muestra del área limpiada. Abre la tapa de la segunda caja y haz SUAVEMENTE 4 siembras en la superficie de la caja, siguiendo el orden de las secciones numeradas como lo hiciste previamente. Cierra la caja y séllala.

5. Divide la tercera caja de Petri en 4 secciones numeradas y desígnalas con el nombre del desinfectante que escogiste (por ejemplo "blanqueador"). Usa el desinfectante escogido para limpiar la otra mitad del objeto que trabajaste antes. Con un nuevo hisopo estéril, toma muestra del área. Repite el proceso de sembrar la caja. Ciérrala y séllala.

6. Esteriliza los hisopos usados con desinfectante y descártalos. Pon las cajas en un lugar apartado y déjalas incubar a la temperatura de 37·C durante 24 a 48 horas. Limpia tu área de trabajo con la solución desinfectante y lava tus manos.

7.- Repite todo el experimento utilizando Cajas de cultivo con Agar sangre sólo que ahora selecciona otro Fomite que no hayas empleado

7. Después de que hayan pasado dos días, mira las cajas de Petri iniciales. No la abras. A la vez examina las otras cajas de Petri sin abrirlas. Crea una tabla que compare las cajas sembradas antes y después de limpiar el objeto (mira la tabla de ejemplo). Asegúrate de indicar si los microbios crecieron en cada siembra.

8. Nota: Cuidadosamente abre las cajas de Petri en un lavaplatos e inúndalas con blanqueador o alcohol sin diluir. Déjalas por una hora y enjuágalas completamente; colócalas en una bolsa plástica, amárrala y descártala. Asegúrate de no tocar la superficie de las cajas cuando las abras y lava tus manos cuidadosamente después de manipularlas. Limpia tú área de trabajo con la solución desinfectante.

 

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué es un cultivo puro de microorganismos?

Se denomina cultivo puro (axénico) al que contiene sólo un tipo de

microorganismos. Los cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de

manera que todos los de el mismo tengan la misma composición genética. Los cultivos puros son esenciales para poder estudiar las características de los microorganismos y para poder identificarlos con seguridad.

2.- Qué es un inóculo?

 

Es algo que implantaremos  en este caso un microorganismo o material infeccioso  que crecerán o se reproducirán, en este medio de cultivo como es la placa Petri.

3.-  Físicamente en un medio de cultivo de microorganismos cuando se dice que no forma un cultivo puro?

 

Un cultivo no se considera puro cuando se encuentran dos o más Microorganismo

en un cultivo o cuando no se selecciona un inoculo específico para el__________ experimento.

 

4.- Qué tipo de técnica empleaste para la siembra de microorganismos?

 

Empleamos algunos métodos como

*siembra por estría en caja.           *siembra en masa en caja.

 

 

5.- ¿Cómo podemos controlar la contaminación microbiana?

Para controlar la contaminación microbiana podemos tomar en cuenta trabajar en un área aislada, no contaminar más objetos, limpiar con blanqueador o alcohol las cajas utilizadas ante de deshacernos de ellas  desinfectantes el área donde trabajamos y lavar nuestras manos.

6.- Completa en la siguiente  tabla  anotando X en los espacios correspondientes a las divisiones realizadas en donde hayan crecido los microorganismos

A)  MEDIOS DE CULTIVO CON AGAR NUTRITIVO

	Caja 1				Caja 2				Caja 3
Siembra	1	2	3	4	1	2	3	4	1	2	3	4
Crecimiento	X				X				X

B)MEDIOS DE CULTIVO CON AGAR SANGRE

	Caja 1				Caja 2				Caja 3
Siembra	1	2	3	4	1	2	3	4	1	2	3	4
Crecimiento	X				X				X

 

 

OBSERVACIONES:   Dibuja todos los pasos empleados en el sembrado de las cajas de Petri con Agar nutritivo. Y los resultados de las colonias bacterianas que crecieron.

 

 

CONCLUSIONES

 En este experimento pudimos comprobar por medio de la práctica y observación que en nuestro medio ambiente se encuentran diferentes microorganismos las cuales para nosotros pueden ser inofensivos pero en algún momento pueden llegar a ser patógenos.